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【產(chǎn)品用途】本產(chǎn)品可應(yīng)用于核酸RNA的快速擴增。

【檢測原理】本產(chǎn)品是基于重組酶介導(dǎo)鏈置換核酸擴增（Recombinase-aid Amplification，RAA）技術(shù)開發(fā)的恒溫核酸擴增檢測試劑，在42℃恒溫條件下特異識別并擴增目標樣本的RNA片段，可用Genchek 熒光檢測儀實時監(jiān)控擴增過程，5-20 min 即可完成擴增檢測。

【技術(shù)原理】重組酶介導(dǎo)鏈置換核酸擴增（Recombinase-aid Amplification，RAA），是一種恒溫核酸快速擴增技術(shù)。 RT-RAA先利用逆轉(zhuǎn)錄酶將 RNA 逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA，從細菌或真菌中獲得的重組酶在常溫下可與引物DNA緊密結(jié)合，形成重組酶/引物復(fù)合體，侵入RNA-cDNA雙鏈核酸模板，在侵入位點重組酶將雙鏈打開，同時單鏈結(jié)合蛋白結(jié)合到被重組酶打開的單鏈上，維持雙鏈模板處于開鏈狀態(tài)。重組酶/引物復(fù)合體開始對雙鏈進行掃描，當引物在模板上搜索到與之完全匹配的互補序列時，重組酶/引物復(fù)合體解體，DNA聚合酶結(jié)合到引物的3’端，開始合成新鏈。成的新鏈又可 以作為模板，最終擴增產(chǎn)物以指數(shù)級增長，完成靶標基因的擴增。經(jīng)過熒光標記的探針與擴增產(chǎn)物結(jié)合，當探針被核酸外切酶酶切后發(fā)出熒光信號，可對擴增過程進行實時監(jiān)控。本試劑盒具有快速、靈敏度高以及特異性強等優(yōu)點，反應(yīng)組分已混合并冷凍干燥成反應(yīng)干粉，操作簡便，易于保存。

【引物設(shè)計與探針設(shè)計】

引物設(shè)計建議方法：RAA核酸擴增技術(shù)對引物設(shè)計的要求與常規(guī)PCR引物設(shè)計有一定的區(qū)別。由兩條寡核苷酸組成一對引物，分別特異性識別一個核酸目標物的上下游核苷酸序列；引物長度在30-35nt之間，序列中無回文序列、連續(xù)單堿基重復(fù)序列和內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)區(qū)；引物Tm值不作為設(shè)計時主要考慮因素；最佳引物對需通過試驗優(yōu)化篩選得到，要求其擴增產(chǎn)物為單一條帶，無非特異性擴增和明顯的引物二聚體。

探針設(shè)計建議方法：探針序列不與引物識別位點重疊，長度在46-52 nt之間，序列避免回文序列、內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)和連續(xù)的重復(fù)堿基；共有四個修飾位點，距離 5’端的≥35 nt的中部位置標記一個 dSpacer（四氫呋喃，THF），作為核酸外切酶的識別位點；THF 位點的上游標記一個熒光基團，下游標記一個淬滅基團，兩個基團的間距為 2-4 nt，THF 距離3’末端≥15nt；在3’末端標記一個修飾基團，例如胺基、磷酸基團、生物素、生物素-TEG 或 C3-spacer。

建議：在開展 RT-RAA （熒光型）擴增反應(yīng)之前，先進行引物的篩選試驗， 以便得到較高的檢測靈敏度

產(chǎn)品說明書：B8205C9 RNA恒溫快速擴增試劑盒（RT-RAA熒光型）.pdf (168.6 K)