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產(chǎn)品信息

貨號	產(chǎn)品名稱	規(guī)格	儲存/運輸條件
082777	干細(xì)胞金牌基質(zhì)膠	10mL	≤-20°C
0827775	干細(xì)胞金牌基質(zhì)膠	5mL	≤-20°C
082777T	干細(xì)胞金牌基質(zhì)膠	1mL	≤-20°C

 產(chǎn)品描述 

    ?；锔杉?xì)胞金牌基質(zhì)膠是一種可溶性的基底膜基質(zhì)膠，這種基質(zhì)是通過基因編輯技術(shù)將多種表達(dá)膠原蛋白的基因序列插入到經(jīng)永生化處理的小鼠細(xì)胞體系中，并在實體中抽提出來的。它的主要成分是層粘連蛋白，接著是膠原蛋白IV、硫酸乙酰肝素蛋白多糖和巢蛋白。基底膜基質(zhì)也含有轉(zhuǎn)化生長因子β、表皮生長因子、類胰島素生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子和在中自然出現(xiàn)的其他生長因子。

推薦應(yīng)用

    干細(xì)胞金牌基質(zhì)膠是一種成熟的hES培養(yǎng)底物。它與特定的培養(yǎng)基結(jié)合使用來培養(yǎng)干細(xì)胞(例如，hESC, iPSC)。此款干細(xì)胞金牌基質(zhì)膠提供了胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞滋養(yǎng)層培養(yǎng)所需的重復(fù)性和一致性，也可用于體內(nèi)分化研究，如畸形成。

產(chǎn)品參數(shù)

來源：小鼠

外觀：①顏色：含酚紅基質(zhì)膠表現(xiàn)為黃色-粉紅色，無酚紅基質(zhì)膠表現(xiàn)為半透明淡黃色； ②形態(tài)：標(biāo)準(zhǔn)型基質(zhì)膠4℃溶解后，呈透明流動液態(tài)狀態(tài)；高濃度基質(zhì)膠0℃溶解后，呈透明流動液態(tài)狀態(tài)，4℃久置呈半凝膠狀。

濃度多樣性： 蛋白濃度范圍在8~26mg/mL之間

內(nèi)毒素： ≤ 4.5EU/ mL

凝膠時間：室溫條件下5-30min凝膠，溫度22°C至37°C時成膠速度加快

2D/3D應(yīng)用非常廣泛：干細(xì)胞研究(分化、維持）、研究（侵襲）、 3D細(xì)胞培養(yǎng)（類器官、3D細(xì)胞球）、體內(nèi)植入（皮下、血管生成、栓塞）

產(chǎn)品質(zhì)量控制規(guī)范

• 通過小鼠抗體產(chǎn)物（MAP）檢測進行常規(guī)小鼠菌落病原體篩選

• 提取自不含LDEV的小鼠細(xì)胞

• 對包括LDEV在內(nèi)的多種病原體進行廣泛的PCR檢測， 確保對生產(chǎn)過程中使用的原材料進行嚴(yán)格控制

• 對細(xì)菌、真菌和支原體進行檢測，確保陰性

• 使用BCA方法測定蛋白濃度

• 使用血清學(xué)方法檢測內(nèi)毒素水平

• 在37℃下進行14天的凝膠穩(wěn)定性測試

• 每批次產(chǎn)品進行生物學(xué)功能驗證（類器官培養(yǎng)與分化實驗；皮下實驗；干細(xì)胞培養(yǎng)；血管生成實驗等）

• 對包括LDEV在內(nèi)的多種病原體進行廣泛的PCR檢測， 確保對生產(chǎn)過程中使用的原材料進行嚴(yán)格控制

使用注意事項

實驗環(huán)境

 • 環(huán)境溫度：20–25℃ ；環(huán)境濕度：40–60%。

 • 請穿戴個人防護裝置，注意實驗室安全。

溫度控制  

• 基質(zhì)膠產(chǎn)品儲存在-20℃時是穩(wěn)定的。通過分裝并一次性使用分裝物來盡可能減少產(chǎn)品的凍融次數(shù)。在-20℃冰箱中儲存分裝物直到準(zhǔn)備使用。請不要儲存在無霜冰箱中。請務(wù)必保持產(chǎn)品的凍存狀態(tài)。

• 因為模基生物干細(xì)胞金牌基質(zhì)膠 在10℃以上會開始凝膠化。所以需謹(jǐn)記：?；锔杉?xì)胞金牌基質(zhì)膠 和所有與?；锔杉?xì)胞金牌基質(zhì)膠 接觸的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)基都應(yīng)該預(yù)冷。在實驗的全部過程中請務(wù)必保持?；锔杉?xì)胞金牌基質(zhì)膠 處于冰上。

避免污染

• 實驗操作人員需嚴(yán)格區(qū)分實驗操作臺、清潔區(qū)和污染區(qū)，確保插取吸頭、加樣、丟棄吸頭的動作呈單向流動。

• 實驗后使用含 0.5% 次氯酸的消毒液對實驗操作區(qū)消毒。

其他

• 請將基質(zhì)膠產(chǎn)品小瓶淹沒在碎冰中，并放置在4℃冰箱里過夜解凍?；锘|(zhì)膠，蛋白濃度高時可能需要更多時間。請將?；锔杉?xì)胞金牌基質(zhì)膠 全程保持在冰上。無論是開蓋取用產(chǎn)品或者對產(chǎn)品進行分裝，請保持無菌操作。

• 操作過程中，需使用預(yù)冷的移液管輕柔地吹打混勻?；锔杉?xì)胞金牌基質(zhì)膠 以確保其均勻性。將?；锔杉?xì)胞金牌基質(zhì)膠 分裝到離心管中，每當(dāng)?；锔杉?xì)胞金牌基質(zhì)膠 堵塞吸頭和/或移液管測量不精確時請更換吸頭。如果將產(chǎn)品放置在4℃的冰上 24-48個小時，凝膠化的模基生物干細(xì)胞金牌基質(zhì)膠 可能會被重新水化。

操作說明

分裝操作說明

    基質(zhì)膠產(chǎn)品儲存在-20℃時是穩(wěn)定的。通過分裝并一次性使用分裝物來盡可能減少產(chǎn)品的凍融次數(shù)。以下為實驗操作者進行分裝操作說明。

1.將基質(zhì)膠置于預(yù)冷盒或碎冰中，放入 4℃冰箱，過夜解凍。

2.將無菌離心管、無菌槍頭等接觸基質(zhì)膠的耗材放預(yù)冷盒中或冰箱中預(yù)冷，分裝前將融化好的基質(zhì)膠表面清潔后放入預(yù)冷盒或碎冰上。

3.在潔凈工作臺中，用1mL移液槍吸取250µL基質(zhì)膠到離心管里(或根據(jù)每次用量多少進行分裝)，標(biāo)注好信息，操作過程中盡量保持低溫，縮短操作時間。

4.分裝完成后放冰盒中，防止傾倒，并于冰箱保存。分裝后放置于-20℃冰箱中儲存?zhèn)溆?。請不要儲存在自動除霜的冰箱中儲存。使用前將基質(zhì)膠插入預(yù)冷盒或碎冰中，并放置于4°C冰箱中，在冰上過夜解凍，使基底膜基質(zhì)膠在穩(wěn)定的低溫環(huán)境中緩慢充分融化。

使用方法說明

包被涂層方法   

    ?；锔杉?xì)胞金牌基質(zhì)膠 可以以幾種方式使用。薄層凝膠法適用于在凝膠頂部接種細(xì)胞，厚層凝膠法允許您在三維基質(zhì)內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞，薄層包被法(不凝膠化)給您提供了復(fù)雜的蛋白質(zhì)層，您可以在其上培養(yǎng)細(xì)胞。您的選擇基于您想要實現(xiàn)的最終結(jié)果，無論是細(xì)胞生長、附著還是分化。

一、薄層凝膠法

1.依照推薦的方法解凍?；锘啄せ|(zhì)。使用預(yù)冷的移液管，將?；?基底膜基質(zhì)混合至均勻。

2.將培養(yǎng)板放置在冰上，以 50 µl/cm2 向生長表面加入?；?基底膜基質(zhì)。

3.將培養(yǎng)板放置在 37 ℃，30 分鐘。

4.如果有必要的話，請在使用無血清培養(yǎng)基輕柔漂洗前吸出未結(jié)合的材料。請確保移液器的吸頭不要刮擦包被的表面。培養(yǎng)板現(xiàn)在可以使用了。

二、薄層包被法

1.依照推薦的方法解凍?；锘啄せ|(zhì)。使用預(yù)冷的移液管，將模基生物 基底膜基質(zhì)混合至均勻。

2.使用無血清培養(yǎng)基將?；锘啄せ|(zhì)稀釋到需要的濃度。對于您的實驗應(yīng)用，您應(yīng)該完成以經(jīng)驗為主的研究來確定您的最適包被濃度。

3.向被包被的容器中加入稀釋的?；?基底膜基質(zhì)。加入的量應(yīng)該足以容易地覆蓋整個生長表面。在室溫下培養(yǎng) 1 個小時。

4.吸出未結(jié)合的材料并使用無血清培養(yǎng)基輕柔地漂洗。培養(yǎng)板現(xiàn)在可以使用了。

三、厚層凝膠法

1.依照推薦的方法解凍?；锘啄せ|(zhì)。使用預(yù)冷的移液管，將模基生物 基底膜基質(zhì)混合至均勻。

2.將培養(yǎng)板放置在冰上。向?；锘啄せ|(zhì)中加入細(xì)胞并使用預(yù)冷的移液管懸浮。以150-200µl/cm2 向生長表面加入?；?基底膜基質(zhì)。

3.將培養(yǎng)板放置在37℃，30分鐘?，F(xiàn)在可以添加培養(yǎng)基了。細(xì)胞也可以培養(yǎng)在這一凝膠的頂部。

細(xì)胞復(fù)蘇：

   使用細(xì)胞復(fù)蘇溶液在冰上 7 小時內(nèi)解聚模基生物基底膜基質(zhì)能夠?qū)崿F(xiàn)將生長在?；锘啄せ|(zhì)上的細(xì)胞最有效地復(fù)蘇，或者使用中性蛋白酶，考慮到連續(xù)培養(yǎng)，中性蛋白酶作為一種金屬酶可以分散細(xì)胞。

應(yīng)用操作說明

   以下以以誘導(dǎo)多能干細(xì)胞培養(yǎng)為例來進行模基生物干細(xì)胞金牌基質(zhì)膠的應(yīng)用實驗操作說明。

 一、培養(yǎng)材料

1、試劑：?；锔杉?xì)胞金牌基質(zhì)膠(貨號082777/0827775/082777T)；ROCK 抑制劑(Y-27632)；DMEM F12/DMEM；mTeSR1/E8 培養(yǎng)基；Accutase 解離劑、PBS(D-PBS)

2、耗材：無菌槍頭、六孔板、無菌 EP 管。

二、培養(yǎng)準(zhǔn)備

1、材料預(yù)冷:

a、將?；锔杉?xì)胞金牌基質(zhì)膠置于冰盒中，放入 4℃冰箱，使膠能過夜緩慢融化;

b、4℃預(yù)冷無菌離心管、無菌槍頭、六孔板、DMEM F12/DMEM；

2、將干細(xì)胞金牌基質(zhì)膠以1:80或1:100比例進行稀釋：

a.將適量 4℃的 DMEM F12/DMEM 移入冷卻的 15/50 mL EP 中；

b、使用移液器將預(yù)冷的槍頭從 EP 管吸取 DMEM F12/DMEM 中移入分裝好的干細(xì)胞金牌基質(zhì)膠，再吸取轉(zhuǎn)移至 EP 管內(nèi)；重復(fù)幾次，直到基質(zhì)膠完全移入到 EP 管中。

c、按比例混合后作為儲備基質(zhì)膠混合液，進行后續(xù)鋪板;

3、制作基質(zhì)膠涂層

a、按 1mL/孔將基質(zhì)膠混合液加入預(yù)冷的六孔板中，輕輕晃動以確保混合液均勻鋪在板上;

b、將 6孔板轉(zhuǎn)移到 37℃孵育過夜(板材可以在孵育一小時后即可使用，但過夜孵育的涂層對細(xì)胞培養(yǎng)效果更佳);

c、使用前吸去涂層上方液體。

4、配置 ROCK 抑制劑(Y-27632)工作液:使用無菌 PBS 將 Y-27632溶解，配置成10mM溶液(1000X)，工作濃度為 10uM;

5、配置含 ROCK 抑制劑 mTeSR1/E8 培養(yǎng)基:將 10mM 溶液加入 mTeSR1/E8 培養(yǎng)基至終濃度為 10uM。

注意:基質(zhì)膠在>4℃時會逐漸聚合成膠，請嚴(yán)格把控操作溫度，控制操作時間;稀釋后的基質(zhì)膠混合液同樣需要冰上操作。

三、細(xì)胞培養(yǎng)

1、復(fù)蘇 iPSC

a.從液氮罐或干冰中取出 ipsc，37℃水域中解凍，解凍應(yīng)迅速完成;

b.用 75% 酒精消毒凍存管后轉(zhuǎn)移到超凈臺/生物安全柜;

c.將細(xì)胞溶液轉(zhuǎn)移到新的 15ml EP 管中，用 DMEM F12/DMEM 沖洗凍存管兩次

d.室溫 300g 離心5min(ipsc對于200-300g的轉(zhuǎn)速都有較好的耐受性,建議使用300g來最大限度捕捉細(xì)胞，標(biāo)準(zhǔn)程序下建議使用 200g)

e.棄上清，用 2mL 含有 ROCK抑制劑的培養(yǎng)基輕柔地重懸iPSC后轉(zhuǎn)移到用鋪好板的孔中，前后搖動使得細(xì)胞均勻分布(建議將每瓶細(xì)胞 1*106裝在六孔板的一個孔內(nèi)使細(xì)胞存活率最大化)

f.將六孔板放回 37℃培養(yǎng)箱，(請在細(xì)胞被轉(zhuǎn)移后立即執(zhí)行，避免細(xì)胞中央密度增加)

g.次日撤去 ROCK 抑制劑，即用無抑制劑的培養(yǎng)基替代含抑制劑的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。

注意:細(xì)胞培養(yǎng)過程中不提倡使用抗生素，其會干擾細(xì)胞和其分化潛能;培養(yǎng)環(huán)境應(yīng)與其他細(xì)胞隔離，兩次傳代后檢測支原體;DMSO 在室溫下對細(xì)胞有毒，復(fù)蘇步驟應(yīng)快速完成。

2、iPSC 傳代

a.將培養(yǎng)上清吸去，用 1mL 的 PBS 清洗后加入 1mL Acuutase

b.轉(zhuǎn)移到37℃培養(yǎng)箱3分鐘，或在顯微鏡下觀察直到大部分細(xì)胞脫落(若細(xì)胞仍然附著可將培養(yǎng)板放在手上，另一手輕輕在你的手上拍打使板發(fā)生輕微震動從而使細(xì)胞脫落);

c.傳代前準(zhǔn)備好基質(zhì)膠涂布的六孔板

d.傾斜培養(yǎng)板，將 Accutase 溶液沿培養(yǎng)層表面轉(zhuǎn)移兩次，分離結(jié)塊并轉(zhuǎn)移到離心管中

e.用 DMEM F12/DMEM 沖洗培養(yǎng)層表面，并與管中的細(xì)胞溶液合并(使用 DMEM/F12或用 PBS 洗滌，建議使用至少 5%的培養(yǎng)基，有利于隨后的造粒和附著);

f.室溫下 300g 離心五分鐘

g.吸去上清，用含有 ROCK 抑制劑的培養(yǎng)基進行重懸，

h.將細(xì)胞加入到涂層板中，輕輕搖動使細(xì)胞分布均勻;

i.將培養(yǎng)板放入 37℃培養(yǎng)箱中孵育。

注意:IPSC生長為單層后則會迅速分化并死亡，為了保持生長和多能性，需在其長滿前進行傳代。

3、iPSC細(xì)胞凍存

a.準(zhǔn)備細(xì)胞和解離液，在解離液解離細(xì)胞過程中，將培養(yǎng)基與 10%DMSO 混合，在凍存管上貼好標(biāo)簽，配置好凍存液(可選 20%血清或血清替代物提高存活率， 也可以使用 90%胎牛血清