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1. 引物/探針設(shè)計(jì)一般原則

RPA擴(kuò)增片段大小：最佳擴(kuò)增片段120-150bp，首次篩選建議設(shè)計(jì)上下游引物各4條，共16種組合。

引物設(shè)計(jì)建議方法：RPA核酸擴(kuò)增技術(shù)對(duì)引物設(shè)計(jì)的要求與常規(guī)PCR引物設(shè)計(jì)有一定的區(qū)別。由兩條寡核苷酸組成一對(duì)引物，分別特異性識(shí)別一個(gè)核酸目標(biāo)物的上下游核苷酸序列；引物長(zhǎng)度在28-32 nt之間，序列中無回文序列、連續(xù)單堿基重復(fù)序列和內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)；引物Tm值、GC含量不作為設(shè)計(jì)時(shí)主要考慮因素；最佳引物對(duì)需通過試驗(yàn)優(yōu)化篩選得到，要求其擴(kuò)增產(chǎn)物為單一條帶，無非特異性擴(kuò)增和明顯的引物二聚體。

探針設(shè)計(jì)建議方法：探針序列長(zhǎng)度在43-50nt之間，序列避免回文序列、內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)和連續(xù)的重復(fù)堿基；共有四個(gè)修飾位點(diǎn)，距離5’端的≥25nt的中部位置標(biāo)記一個(gè)dSpacer（四氫呋喃，THF）作為核酸外切酶的識(shí)別位點(diǎn)；THF位點(diǎn)的上游標(biāo)記一個(gè)熒光基團(tuán)，下游標(biāo)記一個(gè)淬滅基團(tuán)，兩個(gè)基團(tuán)的間距為2-4 nt，THF 距離3’末端≥14nt；3’末端標(biāo)記一個(gè)修飾基團(tuán)，例如胺基、磷酸基團(tuán)、生物素、生物素-TEG 或C3-spacer。

建議用DNAMAN等軟件查看探針和引物的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

2. 引物探針設(shè)計(jì)示范

待擴(kuò)增的目的片段：（注：雙下劃線標(biāo)示的上下游引物區(qū)域GCACGAGGAAGCGGTCA和ATGGGTCACGACGAGATCCT來自參考文獻(xiàn)）

TGATGGCAGGTTGGGCGTCGCTTGGTCGGTCATTTCGAACCCCAGAGTCCCGCTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAAGGCGATGCGCTGCGAATCGGGAGCGGCGATACCGTAAAGCACGAGGAAGCGGTCAGCCCATTCGCCGCCAAGCTCTTCAGCAATATCACGGGTAGCCAACGCTATGTCCTGATAGCGGTCCGCCACACCCAGCCGGCCACAGTCGATGAATCCAGAAAAGCGGCCATTTTCCACCATGATATTCGGCAAGCAGGCATCGCCATGGGTCACGACGAGATCCTCGCCGTCGGGCATGCGCGCCTTGAGCCTGGCGAACAGTTCGGCTGGCGCGAGCCCCTGATGCTCTTCGTCCAGATCATCCTGATCGACAAGACCGGCTTCCATCCGAGTACGTGCTCGCTCGATGCGATGTTTCGCTTGGTGGTCGAATGGGCAG

2.1 探針：首先確定探針的位置

GCAATATCACGGGTAGCCAACGCTATGTCCTGATAGCGGTCCGCCACAC

探針修飾：GCAATATCACGGGTAGCCAACGCTATGTCC [FAM-dT]G[THF][BHQ-dT] AGCGGTCCGCCACAC-C3 Spacer

說明：在T*T、T**T的T上標(biāo)記FAM和淬滅基團(tuán)，把兩個(gè)T之間的一個(gè)堿基換成四氫呋喃THF，探針和擴(kuò)增片段配對(duì)后，四氫呋喃處形成凸起，作為酶識(shí)別位點(diǎn)，在此處將探針切斷，從而發(fā)出熒光。

探針有3個(gè)修飾位點(diǎn)：dSpacerInt 6-FAM-dT，Int BHQ1 dT，3' C3 Spacer

2.2上游引物：

Primer-F-1：GTCAAGAAGGCGATAGAAGGCGATGCGCTG

Primer-F-2：CGATGCGCTGCGAATCGGGAGCGGCGATAC

Primer-F-3：CGATACCGTAAAGCACGAGGAAGCGGTCAG

2.3下游引物：

區(qū)域1：CATTTTCCACCATGATATTCGGCAAGCAGG

反向互補(bǔ)：Primer-R-1：CCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATG

區(qū)域2：GGCATCGCCATGGGTCACGACGAGATCCTC

反向互補(bǔ)：Primer-R-2：GAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCC

區(qū)域3：CACGACGAGATCCTCGCCGTCGGGCATGCG

反向互補(bǔ)：Primer-R-3：CGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTG

上下游引物Primer-F-1、Primer-F-2、Primer-F-3和Primer-R-1、Primer-R-2、Primer-R-3共有9種組合，可從中篩選出較優(yōu)引物對(duì)。

示例：

一條探針搭配不同引物的擴(kuò)增效率對(duì)比（上下游引物各6條，36種組合）：

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